拉曼药学应用

1 激光共聚焦显微拉曼光谱技术简介

拉曼信号是一种由入射光引起的分子的非弹性散射信号，拉曼光谱技术无需样品准备和制备过程，简单，可重复且能够进行无损伤定性定量分析。水的拉曼散射微弱，拉曼光谱也因此成为研究水溶液中的生物样品和化学化合物的理想工具。激光共聚焦显微拉曼光谱技术是一种激光为基础的分析技术，将拉曼光谱分析技术与显微分析技术结合，采用低功率激光器、高转换效率的全息技术，更易于直接获得大量的价值信息，具有非破坏、非侵入、精细分辨、不用试剂和高度自动化等优点，能够快速和非侵入地对细胞和组织进行生化分析，并能提供活体的分子结构信息。利用拉曼光谱对样品进行测定具有很多优点，如选择性高、无需复杂的样品准备、分析混合物时不需分离以及可用于实时跟踪测量等。共焦显微技术应用于拉曼光谱研究后，提高了仪器的灵敏性和分辨率。目前已逐渐广泛应用于材料学、化工学、药学、生物学、矿物学、宝石鉴定学、公安法学等领域。

WITec 产品系列包括拉曼、AFM 和 SNOM 分析成像系统等单独技术解决方案，也包括联用成像系统，无论何时，即使是最基本的系统，均可根据需求扩展和升级的系统设备与功能，从而使我们的客户能够适应未来的挑战。所有 WITec共聚焦拉曼显微镜都采用的高品质模块化设计,具有独特的超高光通量、无与伦比的信号灵敏度以及出色成像能力。

2 激光共聚焦拉曼在药学及生物方向应用

2.1 药物多晶型、成分分布研究及药物一致性评价

逆向工程以目标产品进行逆向分析及研究，是仿制药开发过程中的一个重要环节，在目前的仿制药一致性评价中发挥显著功效。“首仿”是仿制药巨大市场竞争中的最根本准则。如何快速、高效地做到与被仿制药品的品质一致在仿制药研发中至关重要。大多数药物分子都具有可极化的官能团，有着很好的拉曼散射效应，因此，拉曼光谱技术在药物检测方面能够得到广泛的应用。拉曼光谱在药物检测方面的主要优势集中在：所需样品少（1~2 mg），最小程度处理样品，不仅适用于药物粉末，还适用于液体制剂和固体制剂的快速、无损性检测分析。通过拉曼光谱能够解决一些逆向工程分析中的疑难点比如药物活性成分（API）的晶型鉴定、原研制剂的成分确定，以及工艺参数的解析，如 API 分布、包衣层厚度、包衣层数、生产工艺，以及与溶出特性有函数关联的空间分布等。共聚焦拉曼成像可以提供药物化学信息，对原料药设计和固体-液体配制剂的研发有着非常重要的意义。 拉曼成像还可以作为过程分析、专利侵权鉴定和伪造物分析的重要工具。

WITec 共聚焦显微镜系统具有最佳的共聚焦性，衍射极限的纵向分辨率，且大大减少了的背景信号，非常有助于深度剖析并生成 3D 图像。 同时具有出色的光谱和空间分辨率。通过点激光的逐点扫描记录所有像素上的完整光谱，并生成深度剖析或 3D 拉曼图像。3D 空间扫描和深度剖析在分析物体空间尺寸或整个样品特定化合物分布时非常有用。另外，WITec专利的TrueSurface功能可对高低起伏及表面粗糙的样品进行化学成分成像分析，大大扩展了样品的适用范围。

软膏乳状液的共聚焦拉曼图像。蓝色：溶于水的活性成分；红色与绿色：软膏基质。

药片的形貌-共聚焦拉曼图像。左：用 TrueSurface 显微镜获得的药片形貌；右：形貌叠加的共聚焦拉曼图像。

药丸分析

药片的形貌-及药物成分分布图像

2.2 小分子药物成像

在医药学中，药物的运输是学者们关注的重点之一，准确地运输过程及定位，是药物分子能实现特定生理功能的重要保障。制作小分子药物的荧光标签并非容易之事，常用的荧光标签往往比药物分子大很多，这会影响他们的运输特性，因此，利用传统荧光标记方法追踪小分子药物面临很多挑战。

WITec超快拉曼成像，可在几分钟内采集完整的拉曼图像。最新EMCCD光谱探测器与高通量光学共聚焦拉曼成像系统的结合是超快拉曼成像提升的关键，同时极短测量时间及较低激光功率的测量条件非常有利于易损敏感或贵重样品（如活体）的拉曼光谱及成像测量。快速动态过程的拉曼时间分辨也可因超快的光谱采集速度而受益。主要优势：总实验时间减少，同时在给定时间内提供更多有价值的数据，从而降低使用成本；可实现对测量时间有严格要求的标准拉曼成像；非常适合对要求激发功率极低的易损敏感或贵重样品的拉曼分析；时间分辨拉曼测量，可允许快速动态过程的研究（时间序列光谱或图像）。

(a) Schematic of observing real-time molecular event dynamics of apoptosis in living cancer cells using nuclear-targeted plasmonically enhanced Raman nanoprobes. (b) Viable and apoptotic cells produce different images and spectra: (i) flow cytometric analysis; (ii) plasmonically enhanced Rayleigh scattering images; (iii) plasmonically enhanced Raman spectra of untreated viable cells (Control) and apoptotic cells treated with 100 μM H2O2. (Adapted with permission from ref. 10. Copyright 2014 American Chemical Society.)

Schematic of (a) the structures of two types of Au nanoprobes and (b) the zone-controllable SERS effect for imaging of protein-specific glycans on the cell surface. (Adapted with permission from ref. 17. Copyright 2016 The Royal Society of Chemistry.)

2.3中药活性成分分布快速无损检测

共焦显微拉曼光谱对中药尤其是名贵中药的快速、无损的分析测定，可对活性成分分布进行成像分布分析。

2.4药物残留无损分析

在农业生产中， 药物残留问题是随着药物的大量生产和广泛使用而产生的。到目前为止， 世界上化学药物年产量近 200 万吨，约有 1000 多种人工合成的化合物被用作杀虫剂、 杀菌剂、 杀藻剂、 除虫剂和落叶剂等。药物，尤其是有机药物的大量施用，已经造成了严重的药物污染问题， 成为对人体健康的严重威胁。农药残留， 是指施用农药后一部分农药直接或间接残存于谷物、 蔬菜、 果品、 畜产品、水产品中以及土壤和水体中的现象。

2.5生命科学-活细胞、细菌、组织

在生命科学领域中，样品种类非常丰富，包括液体、固体样品及软组织切片等。主要生命科学应用方向有：疾病初期诊断，发病机理及靶向治疗的细胞水平研究，并能提供活体的分子结构信息。

拉曼光谱多维成像技术能在不破坏生物组织的情况下对生物组织进行成像。应用拉曼光谱研究细胞体系又极大的优势，细胞不需要标记或固定等特殊处理，并且可以在生理环境状态下进行拉曼测试。近年来，拉曼光谱技术在医学上发展很快，覆盖了几乎临床诊断的所有科室，取得了居多颇具实效的成在生物大分子中，蛋白质、核酸、磷酸等是重要的生命基础物质，研究它们的结构、构象等化学问题以阐明生命的奥秘是当今极为重要的研究课题。拉曼光谱技术能提供无损、样品制备简便、散射光谱对水不敏感、可重复的测量，更重要的是它能反应与正常生理条件（如水溶液，温度，酸碱度等）相似的情况下的生物大分子的结构变化信息，因而该技术成为生物学大分子检测的首选技术。

WITec的模块化设计基于光纤对光束的有效传输，主机光路部分采用蔡司显微镜，光路设计简单，多部件通过光纤耦合，针对要求特殊光路应用，WITec拉曼系统可以很容易地设置成传统正置反射光路货倒置透射光路模式。从地府投射激发样品或者投射收集信号大大扩展实验的自由度，使系统功能更丰富，更有利于对生物样品实验的观测。

(1) 活细胞

活细胞成分拉曼分析

油酸孵育的巨噬细胞拉曼成像图

(1) 细菌

几种细菌的拉曼成像图

皮肤深层拉曼扫描成像图

1.1 疾病早期诊断

拉曼光谱以其特有的非破坏性、非侵入性、精细的分辨能力、不用试剂和高度自动化等优点，在医学领域发展迅速。病变组织中，即使在细胞尚未发生镜下可见的形态学改变之前，由于细胞增殖、分化或恶变以及一些活性因子的分泌等都会引起组织中、蛋白质和脂类的成分和含量的改变，而拉曼光谱可以检测出样本中此类物质的改变，对肿瘤等疾病早期诊断具有传统病理学诊断所不具备的优势。

WITec 成像与分析工具非常灵活，具有非破坏、非侵入、精细分辨、不用试剂和高度自动化等优点，能够快速和非侵入地对细胞和组织进行生化分析，使您可以根据具体要求选择最佳的成像技术， 特别适合于生命科学研究。共聚焦拉曼显微镜可对生物样品的化学和物理性质进行全面分析，并且可生成深度剖面分析与 3D 图像，以清晰易懂的方式使化学组分可视化。

肝组织细胞发病拉曼成像研究